Project 15

Nanoscale characterisation of integrin-virus interactions

Cavalcanti-Adam, E. Ada
Institute of Physical Chemistry (PCI) & MPI-IS

Spatz, Joachim
Institute of Physical Chemistry (PCI) & MPI-IS

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To gain entry into cells, viruses interact with distinct receptors at the cell membrane for attachment and subsequent internalization. The dynamic mechanisms underlying the entry process are not understood, however. The main objective of this proposal is to define viral and cellular biophysical determinants of virus entry. We will focus on integrins, being the cellular receptors involved in the internalization of several viruses. Our previous observations showed that spatial control of integrin ligands regulates cell adhesion to the extracellular matrix and assembly of integrin-mediated structures. Therefore we anticipate that such parameters will be also important for integrin-dependent virus entry. To elucidate the role of distinct integrin subtypes in viral entry, we will use mammalian reoviruses and adenoviruses as model systems. We will combine our expertise in nanotechnology and biophysics with the expertise of Boulant in virus preparation and imaging for the realization of this project. Two specific aims are proposed to elucidate the mechanisms that promote virus entry.

In Specific Aim 1, we will determine the spatial requirements for viral particle attachment to integrins and their effects on host cell signaling and uptake. Integrins often bind to RGD (arginine-glycine-aspartic acid) motifs on the viral surface. To determine the capacity of specific integrins to serve as virus internalization receptors we will use RGD-based peptides as well as peptidomimetics and integrin-specific ligands as antagonists. We will use nanostructured surfaces for the controlled immobilization and presentation of viral particles or purified proteins and motifs of the viral capsid in spatially defined arrays. We will characterise receptor-ligand interactions at single molecule level, using purified integrin heterodimers and atomic force microscopy as well as EM (Krijnse-Locker/Briggs). Furthermore, we will characterize integrin clustering in cells and determine the binding kinetics and receptor cooperativity in reinforcement of adhesion. In collaboration with Tanaka, we will apply their strength measurement approach and we will model adhesion strengthening mechanisms in collaboration with Schwarz. Finally, cytoplasmic proteins that are known to localize in integrins-mediated contacts will be characterized upon virus attachment. In particular the recruitment and activation of kinases in mediating the specific endocytic uptake of the virus particle will be determined using conventional and high-resolution optical and electron microscopy.

In Specific Aim 2, we will determine the mechanical regulation of virus-host cell interaction, focusing on the spatiotemporal patterns of force maps in cells during virus uptake. Using the described nanopatterning and surface immobilization approaches, we will analyze force distribution at the apical and basolateral side of cells as a function of virus particle density and tethering compliance to the underlying support. Therefore, we will establish a novel force sensor system based on our molecular nanopatterning approach. The force sensor will serve as a molecular linker to the nanopatterned substrate, thereby supporting the controlled presentation of the virus, while at the same time offering various degrees of compliance between the substrate and the virus particles. Furthermore, a light sensitive cleavage side for targeted particle release will be inserted to measure forces upon virus particle uptake. In this way, it will be possible to directly measure forces while monitoring uptake dynamics by total interference reflection microscopy and to also analyze force distribution by force spectroscopy combined with cantilever arrays.

This project will reveal how the physical interactions of viral and cellular proteins cooperate in a spatially defined way that enables virus entry. Additionally, our work will be of relevance in determining the impact of a mechanically hindered transition from an adjacent cell or from the extracellular matrix to the host cell. On the long term, the results of this project might shed light on the design of new compounds against pathogens that use the integrin pathway to enter host cells.


Um in Zellen einzudringen, interagieren Viren mit Rezeptoren an der Zellmembran, an die sie sich anheften und dann von der Zelle aufgenommen werden. Allerdings sind die grundlegenden dynamischen Mechanismen des Prozesses des Viruseintritts nicht verstanden. Das Hauptziel des Antrags besteht darin, die viralen und zellulären biophysikalischen Faktoren für den Viruseintritt in Zellen zu erforschen. Wir konzentrieren uns dabei auf Integrine als zelluläre Rezeptoren, die an der Aufnahme von mehreren Viren beteiligt sind. Unsere vorherigen Beobachtungen ergaben, dass sich durch die räumliche Kontrolle von Integrinliganden die Zelladhäsion an der extrazellulären Matrix und der Aufbau von integrinvermittelten Strukturen regulieren lässt. Daher erwarten wir, dass diese Parameter auch beim integrinabhängigen Viruseintritt eine wichtige Rolle spielen. Säugetierreoviren und Adenoviren sollen als Modellsysteme dienen, um zu klären, welche Rolle bestimmte Integrinsubtypen beim Viruseintritt spielen. Für das Projektziel kombinieren wir unsere Expertise in der Nanotechnologie, Materialforschung und Biophysik mit der Expertise der Boulant-Gruppe auf dem Gebiet der Viruspräparation und Abbildung. Mit Hilfe zweier spezifischer Ziele sollen die Mechanismen, die den Viruseintritt begünstigen, quantitativ erklärt werden.

Im Rahmen des ersten Ziels bestimmen wir die räumlichen Bedingungen für die Anheftung viraler Partikel an Integrine und deren Wirkung auf die Signalübermittlung und Aufnahme in die Wirtszelle. Integrine binden häufig an RGD-Motive (ArgininGlycinAsparaginsäure) auf der viralen Oberfläche. RGD basierte Peptide ebenso wie Peptidomimetika und integrinspezifische Liganden sollen als Antagonisten eingesetzt werden, um zu bestimmen, welche spezifischen Integrine als Virusaufnahmerezeptoren geeignet sind. Nanostrukturierte Oberflächen werden als Plattform dienen, auf der in räumlich definierter Anordnung virale Partikel oder aufgereinigte Proteine und Motive des viralen Capsids kontrolliert immobilisiert und dargestellt werden. Die Rezeptor-Liganden-Interaktion soll auf Einzelmolekülniveau charakterisiert werden mit Hilfe von aufgereinigten Integrin-Heterodimeren und Rasterkraftmikroskopie sowie EM (Krijnse-Locker/Briggs). Darüberhinaus erlaubt der Ansatz mit nanostrukturierten Oberflächen das Clustern von Integrinen in Zellen zu charakterisieren sowie die Bindungskinetik und Rezeptorkooperativität zur Adhäsionsverstärkung zu bestimmen. Diese Aspekte der Virus-Zellbindung werden mit dem Kraftmessungsansatz von Tanaka untersucht und in Zusammenarbeit mit Schwarz mathematisch modelliert. Schließlich werden zytoplasmische Proteine, die bekanntermaßen in integrinvermittelten Kontakten lokalisieren, bei der Virusanheftung charakterisiert. Im Besonderen sollen die Rekrutierung und die Aktivierung von Kinasen bei Vermittlung der spezifischen endozytischen Aufnahme des Viruspartikels mit konventioneller und hochauflösender optischer und Elektronenmikroskopie bestimmt werden.              

Im Rahmen des zweiten Ziels soll die mechanische Regulierung der Virus-Wirtszell-Interaktion bestimmt werden. Der Fokus liegt hierbei auf den raumzeitlichen Mustern der Kraftregulierung in Zellen bei der Virusaufnahme. Mit Hilfe des neu entwickelten Nanostrukturierungs- und Oberflächenimmobilisierungsansatzes werden wir die Kraftverteilung an der apikalen und basolateralen Seite der Zellen als eine Funktion der Viruspartikeldichte und Bindungsnachgiebigkeit an das darunterliegende Substrat analysieren. Außerdem wird eine lichtempfindliche Spaltungsstelle in die molekulare Verbindung zwischen Nanostruktur und Viruspartikel für die gezielte Partikelfreisetzung eingebracht. Zur Quantifizierung der bei der Partikelaufnahme wirkenden Kräfte soll ein neuartiges Kraftsensorsystem basierend auf unserem molekularen Nanostrukturierungsansatz entwickelt werden, welches bezüglich räumlicher, zeitlicher und kraftbasierender Auflösung für die Viruspartikelaufnahme optimiert sein wird. Auf diese Weise wird es möglich sein, Kräfte bei der Viruspartikelaufnahme direkt zu messen und gleichzeitig die Aufnahmedynamik mit der totalen Interferenzreflexionsmikroskopie zu analysieren.

Dieses Projekt wird aufzeigen, wie die physikalische Interaktion von viralen und zellulären Proteinen auf räumlich definierte Weise zusammenwirkt, um den Viruseintritt zu ermöglichen. Darüberhinaus wird unsere Arbeit dazu beitragen zu erforschen, was passiert wenn der Übergang von einer benachbarten Zelle oder der extrazellulären Matrix zur Wirtszelle mechanisch blockiert wird. Auf lange Sicht können die Ergebnisse dieses Projekts neue Ansätze liefern für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe gegen Pathogene, die den Integrinweg benutzen, um in Wirtszellen einzudringen.


News

8 December 2016 | Leibniz-Prize 2017 to Prof. Dr. Joachim P. Spatz by the German Science Foundation (DFG)

Joachim Spatz is appointed since 2000 as Professor for Biophysical Chemistry at the Institute for Physical Chemistry at the University of Heidelberg. From 2004-2015 he was also Director of the Max-Planck-Institute for Intelligent Systems [...]

Project Staff

Marta Fratini, PhD