Visualisation of Hepatitis B Virus entry and spread

Urban, Stephan
Dept. of Infectious Diseases – Molecular Virology

 

Hepatitis B virus (HBV) chronic infections cause serious medical burden worldwide. Therapies are limited and in most cases non-curative. The life cycle of HBV, especially the early events of infection remain unclear. The recent identification of sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP) as the long-sought HBV receptor and the establishment of efficient infection models by constitutive expression of NTCP open the door for visualizing the trafficking of NTCP and the entry processes of HBV.

In this project, we will fluorescently label (i) NTCP, NTCP-variants and cellular structures (cell membrane, endosomes, lysosomes, etc.), (ii) NTCP binding viral peptides, and (iii) different components of HB virions (envelope, nucleocapsids) through fluorescent protein tagging, chemical labelling and newly developed labelling strategies such as amber suppression and click chemistry (in collaboration with Lemke P7). Then we will visualize the trafficking of NTCP and peptidic ligands and the entry processes of HBV (attachment, endocytosis, membrane fusion, and delivery of the nucleocapsid to the nucleus) using high sensitivity and spatiotemporal resolution microscopy tools.

Visualisation of HBV entry will allow us to better understand which cellular mechanisms it hijacks and help in finding new anti-viral strategies. 


Chronische Erkrankungen durch das Hepatitis B Virus (HBV) führt zu schwerwiegenden medizinischen Belastungen. Die Therapien sind limitiert und in den meisten Fällen nicht kurativ. Der Lebenszyklus von HBV, vor allem die frühen Schritte der Infektion, bleiben unbekannt. Vor kurzem wurde mit dem Natriumtaurocholat-Rezeptor (NTCP) der langgesuchte HBV Rezeptor identifiziert. Diese Entdeckung erlaubt nun effiziente Infektionsmodell mittels konstitutiver Expression von NTCP und eröffnet damit die Möglichkeit den Transport von NTCP und die Eintrittsmechanismen von HBV zu visualisieren.

In diesem Projekt werden wir (i) NTCP, NTCP Varianten und zelluläre Strukturen (Zellmembran, Endosomen, Lysosom etc.), (ii) NTCP bindende virale Peptide und (iii) verschiedene Komponenten von HB Virionen (Membran, Nukleokapsid) mit Fluoreszenz markieren durch Fusion mit fluoreszierenden Proteinen, chemischen Markierungsmethoden und neu entwickelten Markierungsmethoden wie Amber Suppression und Click Chemistry (in Zusammenarbeit mit Lemke P7). Danach werden wir den Transport von NTCP und peptidischen Liganden und die Eintrittsmechanismen von HBV (Bindung, Endozytose, Fusion mit der Membran and Transport des Nukleokapsids zum Zellkern) mit hochsensiblen Mikroskopen bei räumlicher und zeitlicher Auflösung beobachten.

Die Visualisierung des Eintritts von HBV ermöglicht uns besser zu verstehen welche zellulären Mechanismen von dem Virus ausgenutzt werden und unterstützt bei der weiteren Entwicklung von anti-viralen Strategien.

Colocalisation of MyrB (red) with
GFP-tagged NTCP (green) in HepG2 cells

The human hepatitis B virus (HBV) is the causative agent of acute and chronic hepatitis B. Presently 350 million people are suffering from chronic hepatitis B and are prone to develop HBV-associated liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Therapies for chronically infected patients are limited and in the majority of cases non-curative. Despite this medical burden, the viral life cycle, especially the early events of HBV infection, receptor mediated entry, membrane fusion, delivery of the DNA-containing nucleocapsid to the nucleus and the formation of the viral cccDNA, are only partially understood. This lack of knowledge could be attributed to lack of susceptible cell culture systems. The recent identification of sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP) as the long sought HBV receptor opens a new area in HBV research. Constitutive expression of NTCP in non permissive HepG2 and HuH7 cell lines rendered these otherwise refractory cell lines susceptible for HBV infection (Ni et al., in revision) and therefore provided novel tools for systematic studies on virus entry including high resolution real time imaging of fluorescently labelled peptidic ligands and tagged virions. Moreover, the possibility to label NTCP and fusion-deficient but binding competent NTCP-variants with GFP or other fluorescent proteins without losing receptor functionality allows imaging of the receptor alone or in complex with labelled peptidic ligands or virions.

This project aims at resolving the early events of HBV infection using high resolution imaging techniques available in the consortium. We will initiate our analyses by investigating the trafficking of fluorescently labeled NTCPs from different species, expressed in susceptible hepatoma cell lines and define the underlying entry pathway using specific inhibitors and shRNAs interfering with key players involved in different endocytic pathways. A set of well characterised fluorescently labelled peptidic ligands of NTCP will be used to investigate whether ligand induced resorting events influence the dynamics of receptor trafficking. We will take advantage of chemically labelled highly purified HB virions to dissect the kinetics of the early entry events (attachment to heparin sulfate) and formation and localisation of the high affinity NTCP/virus complexes. Taking advantage of fusion incompetent mutants of NTCP we will analyse at which stage separation of the viral membrane from the nucleocapsid occurs.

In the long term perspective we will generate recombinant, infection competent HBV particles incorporating tags allowing specific labelling of either envelope proteins or nucleocapsids. Their implementation will help to directly trace nucleocapsids after post-fusion release from the envelope on its way to the nuclear pore complex (with Lemke). In summary, we will elucidate temporal, spatial and functional aspects of HBV entry. The results will not only contribute to the understanding of HBV entry, but are expected to provide a basis for the development and analysis of new anti-viral strategies targeting early infection events.

Das humane Hepatitis B Virus ist der Auslöser für die akute und chronische Hepatitis B. Zurzeit sind ca. 350 Millionen Menschen chronisch infiziert. Diese Patienten haben ein hohes Risiko an HBV-assoziierten hepatozellulären Karzinomen zu erkranken. Derzeit verfügbare therapeutische Optionen sind limitiert und zumeist nicht kurativ. Trotz der medizinischen Relevanz dieses Pathogens sind insbesondere frühe Schritte des viralen Lebenszyklus, etwa der Mechanismus des rezeptorvermittelten Übertritts des viralen Partikels in die Wirtszelle, der Zeitpunkt der Membranfusion und die Bildung der cccDNA, nur teilweise verstanden. Die vor kurzem erfolgte Identifikation des Natriumtaurocholat-Rezeptors (NTCP) als HBV-Rezeptor eröffnet ein neues Kapitel in der HBV-Forschung. Konstitutive Expression von NTCP in nicht HBV permissiven Zelllinien (z.B. Huh7 und HepG2) ermöglicht die Infektion dieser Zellen mit HBV (Ni et al., in revision) und erlaubt die systematische Analyse früher Schritte der HBV-Infektion mit Hilfe konfokaler Mikroskopie fluoreszenzgekoppelter Peptidliganden und fluoreszenzmarkierter Partikel. Darüber hinaus erlauben die direkte Fluoreszenzmarkierung von NTCP sowie die Expression fusionsdefizienter, aber bindungskompetenter NTCP-Varianten mit GFP oder anderen fluoreszierenden Proteinen ohne Verlust der Rezeptorfunktion die Beobachtung des Rezeptors alleine oder in Verbindung mit Peptidliganden und/oder viralen Partikeln.

Dieses Projekt zielt auf die Aufklärung früher Schritte der HBV-Infektion mit Hilfe hochauflösender Mikroskopie-Techniken in enger Kooperation mit anderen Mitgliedern des Konsortiums. Ausgehend von der Analyse des Transportes von fluoreszenzmarkierten humanem NTCP und NTCP-Varianten verschiedener Organismen in HBV permissiven Hepatomzelllinien werden wir die Mechanismen des NTCP-Transportes aufklären. Die Verwendung spezifischer Inhibitoren, shRNAs und dominant negativer Mutanten wichtiger Proteine, die in unterschiedlichen endozytotischen Vorgängen eine Rolle spielen, wird uns in die Lage versetzen, den genauen Mechanismus der NTCP-Endozytose aufzuklären. Weiterhin wird uns die Verwendung gut charakterisierter Peptid-Liganden einen ersten Hinweis geben, ob die Bindung von Komponenten der HBV-Hülle an NTCP eine Veränderung im endozytotischen Mechanismus von NTCP bewirkt. Unter Verwendung hochaufgereinigter fluoreszenzmarkierter Virionen werden wir die verschiedenen relevanten Schritte in der Bindung und Endozytose von HBV/NTCP Rezeptorkomplexen aufzeigen und charakterisieren. Schlussendlich werden wir unter Verwendung von NTCP-Varianten evaluieren, an welchem Punkt der Endozytose die Separation von viralem Kapsid und viraler Hülle erfolgt, und damit den Zeitpunkt der Membranfusion charakterisieren.

Über die Projektlaufzeit hinaus werden wir durch die Entwicklung rekombinater infektionskompetenter HBV-Partikel, die das Einbringen spezifischer Fluoreszensmarker in virale Hüllproteine oder aber des viralen Kapsids ermöglichen, die Möglichkeit schaffen, den Weg der Bestandteile des HBV-Partikels direkt zu verfolgen. Dies wird es uns ermöglichen, Nukleokapside nach der Membranfusion auf ihrem Weg zum Zellkern zu verfolgen und die Mechanismen des Kapsidtransports aufzuklären. Zusammenfassend werden wir sowohl funktionale, räumliche und zeitabhängige Schritte des Eintritts von HBV-Partikeln in die Wirtszelle aufklären. Die erhaltenen Resultate werden nicht nur wichtige Fragestellungen des HBV-Lebenszyklus beantworten, sondern auch dazu beitragen, die Entwicklung neuer antiviraler Strategien voranzutreiben.

Project Staff

Benno Zehnder, PhD

Florian Lempp, PhD