Project 6

Dynamics of events in HIV-1 replication

Müller, Barbara
Dept. of Infectious Diseases – Virology

apl. Prof. Dr. B. Müller

Information

The events occurring between entry of the viral capsid into a host cell and arrival of the viral genetic information in the cell nucleus represent the most enigmatic part of the HIV-1 replication cycle. Fusion of the viral envelope with the cell membrane releases the capsid into the cytoplasm, where the RNA genome contained in the capsid is converted into double stranded DNA by the viral reverse transcriptase. Upon transport of this DNA copy into the nucleus it is inserted into the host cell genome by the viral integrase. While textbooks depict disassembly of the capsid (uncoating) as initial step of this sequence, many studies indicate that processes occurring in the ‘post entry’ phase are complex and intertwined, with a capsid-like structure hiding the viral genome from host cell defense mechanisms and possibly recruiting cellular factors that promote transport to and into the nucleus. Therefore, tight coordination of events in time and space is critical for HIV replication.

Our project is aimed at elucidating the dynamics and pathways of HIV post-entry events, the fate and functional role of the viral capsid and the influence of specific host cell proteins on the course of events. Traditional ensemble measurements are not well suited to capture dynamics of complex, fast and transient interactions. Therefore, we want to apply microscopic methods to follow individual viruses through the initial steps of infection. For this, we establish and employ minimal invasive fluorescent labeling strategies in order to detect important components of HIV replication complexes in live cells, in collaboration with the Lemke (P7) and Schultz (Z3) group: We also work towards generating fully replication competent fluorescent HIV variants that allow us to follow their spread from cell to cell in complex 3D cellular environments. These variants will also be applied in projects of the Kräusslich (P5) and Fackler (P8) groups.


Die entscheidenden Ereignisse zwischen dem Einritt des Humanen Immundefizienz-Virus in eine Wirtszelle und der Ankunft der genetischen Information des Virus im Zellkern sind bisher nur wenig verstanden. Durch Fusion der Virushülle mit der Zellmembran gelangt das Viruskapsid ins Zytoplasma. Dort wird das im Kapsid verpackte RNA Genom in doppelsträngige DNA umgeschrieben (‚Reverse Transkription‘). Diese wird in den Zellkern transportiert und in das Erbgut der Wirtszelle integriert. In Lehrbüchern wird der Zerfall der Kapsidhülle in der Zelle (‚Uncoating‘) als erster Schritt dieser Abfolge dargestellt; viele Daten belegen jedoch, dass die Ereignisse in der ‚post entry‘ Phase von HIV nicht nacheinander ablaufen, sondern in komplexer Wechselwirkung miteinander stehen. Das Kapsid – oder eine Kapsid-ähnliche Hülle – spielt dabei offenbar eine wichtige Rolle: es schützt die neu entstehende virale DNA vor zellulären Abwehrmechanismen und rekrutiert Wirtsfaktoren, die für den Transport der DNA in den Zellkern benötigt werden. Eine genaue Kontrolle der Dynamik von uncoating, reverser Transkription und Kernimport in Raum und Zeit ist daher entscheidend für die Virusreplikation.

In unserem Projekt untersuchen wir die Dynamik der Ereignisse in der HIVpost-entry Phase, die Rolle des Viruskapsids und den Einfluss bestimmter zellulärer Faktoren auf diese Ereignisse. Mit biochemischen Verfahren gelingt es nicht, die Dynamik schneller, transienter, nicht synchronisierter Abläufe zu erfassen. Daher wenden wir moderne mikroskopische Methoden an, die es erlauben, einzelne Viren auf ihrem Weg durch die Zelle zu verfolgen. Hierfür etablieren wir in Zusammenarbeit mit den Arbeitsgruppen Lemke und Schultz minimal invasive Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung, mit denen wir wichtige Bestandteile der HIV Eintrittskomplexe sichtbar machen können. Darüber hinaus entwickeln wir voll replikationskompetente fluoreszenzmarkierte HIV Varianten, die es uns erlauben, die Ausbreitung des Erregers in komplexen Zellsystemen zu verfolgen. Diese Varianten werden auch in den Projekten der Gruppen Kräusslich und Fackler zum Einsatz kommen.

HIV-1 replication is characterised by highly dynamic molecular events. Successive replication steps (e.g. virus maturation and cell entry entry, or capsid uncoating and reverse transcription of the viral genome) are functionally linked and require tight spatio-temporal control. Analysing the sequence of events and dynamics of individual steps is thus crucial for our molecular understanding of the viral replication process. However, viral replication occurs in a complex cellular environment on a rapid time scale. Furthermore many virions interact with a single host cell in a non-synchronised manner, possibly even following alternative pathways. This hampers ensemble measurements and renders microscopic observation of individual particles in live cells (single virus tracing, SVT) a key technology for studying replication dynamics.

In this project we want to apply SVT for a detailed quantitative analysis of HIV-1 replication in individual cells and cell-cell transmission. This project takes advantage of the unique opportunity provided by this SFB to link our virological and imaging expertise with groups developing cutting edge labelling strategies (Lemke, Z-project Schultz) and image analysis algorithms (Rohr, Z-project Hamprecht). In the initial funding period, we will focus on the incompletely understood post-entry events. Building on our previous work (fluorescent HIV-1 derivatives, SVT analyses) we develop and apply strategies to follow individual virions from entry into the host cell cytoplasm through reverse transcription of the genome and nuclear import of the viral cDNA with high time resolution, in order to characterise sequence and dynamics of molecular events (Aim 1). These analyses are expected to provide a better understanding of the nuclear transport and import pathway(s) of HIV-1 replication complexes and the role of viral proteins, most importantly integrase and capsid. We plan to study dynamic transitions of subviral complexes, including recruitment of distinct host factors and their influence on these events. By this, we aim at elucidating the functional link between capsid uncoating, reverse transcription and nuclear import and at clarifying the role of host cell factors implicated in HIV-1 post-entry events, for which evidence regarding their function and interaction partners is unclear or conflicting (e.g. TNPO3, RanBP2, Nup153, CPSF6).

This work will be complemented by approaches to increase replication competence and fluorescence stability of labelled virus derivatives to allow for analysis of cell-cell transmission (Aim 2), with the long-term goal of tracing HIV-1 replication steps in complex cell systems. Towards this, we will explore click-labelling strategies and a mutagenesis-selection approach for labelling of the viral envelope glycoprotein and the inner structural protein Gag, respectively. The aims of this project are closely connected to questions addressed in the projects on nuclear import of pathogens (Lemke), HIV-1 entry and cell-cell transmission (Kräusslich), subviral architecture (Kräusslich, Krijnse-Locker/Briggs) and HIV-1 spread in complex cell systems (Fackler). Labelling and analysis techniques developed in collaboration with the Lemke and Z-Project Schultz, and Rohr and Z-Project Hamprecht, respectively, will benefit all projects that involve live-cell microscopy of pathogens.

Der Replikationszyklus von HIV-1 umfasst eine Abfolge sehr dynamischer molekularer Ereignisse. Aufeinander folgende Replikationsschritte (z.B. proteolytische Reifung des Viruspartikels und Zelleintritt, oder der Zerfall des Kapsids und reverse Transkription des Virusgenoms) sind funktionell miteinander verknüpft; die genaue zeitliche und räumliche Koordination dieser Schritte ist daher sehr wichtig für die Virusreplikation.

Die quantitative Untersuchung der Reihenfolge molekularer Ereignisse und der Dynamik einzelner Schritte ist daher essentiell für das Verständnis der HIV-1 Replikation. Virale Replikationsschritte sind allerdings schnell und laufen innerhalb der komplexen Umgebung der Wirtszelle ab. Außerdem interagiert eine große Zahl von Viruspartikeln asynchron mit einer einzelnen Wirtszelle, und einzelne Partikel folgen möglicherweise unterschiedlichen Wegen. Das erschwert oder verhindert die Interpretation von Ensemble-Messungen und verleiht der mikroskopischen Beobachtung einzelner Partikel in lebenden Zellen (single virus tracing oder SVT) eine zentrale Bedeutung.

In diesem Projekt wollen wir HIV-1 Replikation in einzelnen Zellen, sowie langfristig die Zell-Zell-Übertragung des Virus, detailliert und quantitativ mittels SVT untersuchen. Dieses Projekt nutzt die einzigartige Gelegenheit, im Rahmen des geplanten SFB unsere Erfahrung in HIV-1 Virologie und Fluoreszenzmikroskopie mit der Expertise von Gruppen zu verbinden, die neuartige Markierungsstrategien (Lemke, Z-Projekt Schultz), bzw. Algorithmen zur automatischen Bildanalyse (Rohr, Z-Projekt Hamprecht) entwickeln.

In der ersten Förderperiode werden wir uns auf die unvollständig charakterisierten Ereignisse in der frühen Phase nach dem Zelleintritt konzentrieren. Aufbauend auf unseren bisherigen Arbeiten (Fluoreszenzmarkierung von HIV-1, SVT) planen wir, Strategien zur Verfolgung einzelner Viren mit hoher Zeitauflösung vom Zelleintritt über reverse Transkription bis zum Kernimport der viralen DNA zu entwickeln, und damit die Abfolge und Dynamik einzelner Schritte in diesem Prozess zu charakterisieren (Ziel 1). Diese Informationen sollten entscheidend zum Verständnis des Kerntransport- und -importmechanismus (oder mehrerer alternativer Mechanismen) von HIV-1 und der Rolle viraler Proteine, insbesondere Integrase und Kapsidprotein, beitragen. Die quantitative Analyse von dynamischen Veränderungen subviraler Komplexe und deren Beeinflussung durch zelluläre Faktoren soll besonders die funktionelle Verknüpfung der frühen Schritte nach Zelleintritt von HIV-1 (Kapsidzerfall, reverse Transkription und Kernimport) beleuchten. In diesem Zusammenhang interessiert uns auch die Rolle Wirtsfaktoren, die an diesen Schritten beteiligt sind und über deren molekulare Funktion bisher unklare oder widersprüchliche Informationen vorliegen (z.B. TNPO3, RanBP2, Nup153, CPSF6).

Ergänzend zu diesen Arbeiten werden wir Strategien zur Herstellung fluoreszenzmarkierter HIV-1 Derivate mit erhöhter Replikationskompetenz entwickeln (Ziel 2); langfristiges Ziel ist hierbei die Möglichkeit, die Ausbreitung von HIV-1 in komplexen Zellsystemen zu verfolgen. Hierfür werden wir neu entwickelte ‚click-labeling‘ Techniken sowie ein Mutagenese-Selektions-Verfahren für die Markierung des viralen Hüllproteins Env, bzw. des Haupt-Strukturproteins Gag, einsetzen. Die Zielsetzung dieses Projekts ist eng verknüpft mit Fragestellungen, die in den Projekten zu Kernimport von Pathogenen (Lemke), HIV-1 Zelleintritt und Zell-Zell-Übertragung (Kräusslich), HIV-1 Virusarchitektur (Kräusslich, Z-Projekt Krijnse-Locker/Briggs) und HIV-1 Ausbreitung in komplexen Systemen (Fackler) adressiert werden. In Kooperation mit den Gruppen Lemke, Z-Projekt Schultz, Rohr und Z-Projekt Hamprecht entwickelte Markierungs- bzw. Analysemethoden werden allen Projekten, die sich mit Lebendzellmikroskopie von Pathogenen befassen, zu Gute kommen.

Project Staff

Volkan Sakin, PostDoc