Project 7

Pathogen passage through the Nuclear Pore Complex

Lemke, Edward
The European Molecular Biology Laboratory (EMBL)

Dr. Edward Lemke

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In order to hijack the host machinery, many viruses translocate their genetic material through nuclear pore complexes (NPC) into the nucleus where it is replicated. The MDa sized NPCs, build from hundreds of proteins, are the major gateway across the nuclear envelope (NE) and form a selective permeability barrier that contains a central channel filled with a matrix of flexible proteins of elusive structure and working mechanism. Pathogens have evolved different strategies to utilise the NPC import machinery, but the exact mechanism and the viral and host cell determinants involved are unknown or under debate in most cases. We aim to decipher the molecular structure and dynamics of the actual pathogen mediated NPC transport mechanism focussing on two different viral systems, the Human Immunodeficiency Virus (HIV) and the Hepatitis B virus (HBV) pathways.

HBV capsid is a large structure (~35 nm) and how such a large structure can pass the NPC intact, and what structural motions inside the NPC facilitate this process is currently not understood. Single virus tracking and complementary superresolution studies of fluorescently engineered NPCs will be performed to study this process. In the HIV pathway, a currently ill-defined pre-integration complex (PIC) is entering the nucleus. Furthermore, several distinct proteins of the NPC machinery have been implied to directly interact with parts of the PIC. We will use a bottom up approach, starting with defined components of the PIC to study interactions with the NPC. To achieve molecular resolution, we will employ state of the art single molecule and superresolution microscopy techniques to visualise protein flexibility and protein-protein interactions between the pathogen and the NPC with high spatial (nanometer) and temporal resolution (millisecond).

Fundamental to such a high resolution approach is to minimally invasively engineer proteins with ultra-photostable small fluorescent dyes suitable for long-term single molecule fluorescence observation. To this end, we aim to adapt a recently developed semi-genetic labelling method based on site-specific encoding of unnatural amino acids to this problem which we have and continue to develop together with the Schultz group. These technologies allow visualising similarities, differences and specific of the diverse pathogen-NPC interactions. Our study will initially focus on non-infectious model systems that can benefit from their high genetic amenability and access to state of the art technology. Our efforts will greatly profit from the possibility to collaborate with groups from virology (Müller, Urban, Kräusslich), and the goal is to strengthen the synergies between high resolution model studies and the actual infectious and physiological systems to converge on a common picture of viral passage mechanism.


Um das virale Genom in den Kern einzuschleusen, überlisten viele Viren die natürliche Transportmaschinerie, deren zentrales Element Kernporen sind. Kernporen gehören zu den größten molekularen Maschinen in der Zelle und sind aus hunderten von Proteinen zusammengesetzt, die zu einer Gesamtmasse von über 100 MDa beitragen. Kernporen sitzen in der Doppelmembran der Kernhülle und formen einen Kanal, der eine Matrix-gefüllte Permeabilitätsbarriere enthält. Diese Matrix hat eine unbekannte Struktur, da sie weitestgehend aus sehr flexiblen und intrinsisch ungeordneten Proteinen aufgebaut ist. Pathogene haben vermutlich verschiedene Mechanismen entwickelt, um die Kerntransportmaschinerie für ihre Zwecke zu benutzen. Die molekularen Details dieser Virus-Zell-Interaktionen sind allerdings weitestgehend ungeklärt. Wir wollen unseren Kenntnisstand verbessern und für das HI Virus und das HB Virus virale Transportmechanismen durch die Kernporen genau studieren.

Wie derartig große Objekte, wie beispielsweise das über 35 nm große HBV Kapsid, in den Kern eindringen, stellt die Wissenschaft derzeit vor Rätsel, da dazu große strukturelle Veränderungen in der Kernpore stattfinden müssen. Um dies aufzuklären, werden wir den Eintritts-Prozess mit hochauflösenden Fluoreszenmethoden studieren, die es erlauben, das Virus zu verfolgen und zeitgleich die Struktur der Kernpore zu visualisieren. Im Falle des HI Virus wird ein Preintegrationskomplex durch die Kernpore transportiert, dessen genaue Zusammensatzung nach wie vor Stand aktuellster Forschung ist. Wir werden einen systematischen Ansatz wählen, um zu ermitteln, ob und welche Kernporenproteine eventuell in einen HI-spezifischen Transportmechanismus direkt verwickelt sind. Um Molekülplastizität im Kerntransport von Viren direkt messen zu können, werden auch hier höchstauflösende Einzelmolekülmethoden aus dem Bereich der Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz kommen. Dabei liegt der Fokus auf den molekularen Interaktionen zwischen Proteinen des Pathogens und den Kernporenbestandteilen, die mit nanometer- und millisekunden-genauer Auflösung erfasst werden können.

Grundlegend für solche Techniken ist die Möglichkeit, mit hoch-photostabilen und kleinen, synthetisch hergestellten Farbstoffen arbeiten zu können. Um diese seitenspezifisch in die Proteine einbauen zu können, werden wir eine semi-genetische „Klick“-Methode benutzten, die wir zusammen mit Schultz entwickelt haben und weiter ausbauen. Die Kombinationen von modernen Färbemethoden und Mikroskopietechniken wird es erlauben, Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen verschiedenen natürlichen und Virus-spezifischen Transportprozessen aufzudecken. Wir werden am Anfang mit nicht-infektiösen Modellsystemen arbeiten, um das volle Potenzial solcher modernen Techniken schnell nutzen zu können. Dabei werden diese Untersuchungen sehr von der Zusammenarbeit mit den virologischen Arbeitsgruppen profitieren (Müller, Urban, Kräusslich), mit denen entsprechende Untersuchungen in der Folge auch an infektiösen Systemen durchgeführt werden, um so die viralen Mechanismen des Zellkern-Eintritts im molekularen Detail verstehen zu können.

News

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