HIV-1 spread in complex cell systems

Prof. O. T. Fackler
Dept. of Infectious Diseases – Virology

Bildnachweis:  Universität Heidelberg,
Kommunikation und Marketing

The Acquired immunodeficiency syndrome AIDS results from the continued loss of CD4 T helper cells in patients infected with the causative agent, Human Immunodeficiency virus (HIV). Although more than 30 years of intense research efforts generated valuable insight into the molecular mechanisms of HIV replication and pathogenesis, the processes that govern the destruction of CD4 helper cells in AIDS patients as well as strategies of virus spread in the infected host remain poorly understood. This lack of knowledge reflects, at least in part, shortcomings in the cell culture models mostly used to study HIV infection as they rarely reflect the complex composition, architecture and motility of HIV target cells in their physiological environment. The long-term goal of this project therefore consists of reconstituting ex vivo patho-physiological aspects of HIV-1 infection in target organs of AIDS patients. This will be attempted using 3D cultures in which cells are embedded in collagen matrices amenable to systematic variation of biophysical parameters, modulation of their cell composition, and visualization of cell movement and virus transmission. Initially using exclusively T lymphocytes as HIV-1 target cells, the complexity of these cultures will increase in the course of the project. Quantitative measurements of parameters governing HIV spread in this model system will be used to generate and refine mathematical models of these processes. Together we expect these analyses to yield novel insight into the mechanisms of HIV spread and pathogenesis.

Die erworbene Immunschwäche AIDS wird in Patienten, die mit dem verantwortlichen Erreger, dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV), infiziert sind durch den kontinuierlichen und lange anhaltenden Verlust von T Helferzellen hervorgerufen. Obwohl über 30 Jahre intensive Forschungsarbeit wertvolle Einblicke in die molekularen Wirkweisen der HIV Replikation und Pathogenese erbracht haben, sind die Prozesse, die zur Zerstörung von T Helferzellen führen und die Ausbreitung der Virus im infizierten Patienten regulieren, nur unzureichend bekannt. Diese Wissenslücken beruhen, zumindest teilweise, auf Limitationen der häufig für Studien der HIV Infektion verwendeten Zellkulturmodelle, welche die komplexe Zusammensetzung, Architektur und Fortbewegung von HIV Zielzellen der physiologischen Umgebung nur unzureichend darstellen. Das langfristige Ziel dieses Projektes besteht daher in der Rekonstitution der Patho-Physiologie der HIV Infektion in Zielorganen in ex vivo Zellkulturen. Dies soll durch die Verwendung von 3D Kulturen erzielt werden, in denen Zellen in Collagen Matrices eingebettet werden. In diese Kulturen können biophysikalische Parameter systematisch verändert werden, die Zellzusammensetzung kann variiert und Zellfortbewegung sowie Virusübertagung bildlich dargestellt werden. Zunächst werden ausschließlich T Lymphozyten als HIV Zielzellen eingesetzt mit dem Ziel, die Komplexität des Zellmodells im Verlauf des Projekts schrittweise zu erweitern. Die quantitative Bestimmung von für die Ausbreitung von HIV in diesen Kulturen relevanten Parametern wird helfen, mathematische Modelle dieser Prozesse zu verbessern. Zusammen werden diese Untersuchungen grundlegend neue Erkenntnisse über die Mechanismen der Ausbreitung und Pathogenese von HIV erbringen.

Ex vivo model systems (Reference: Fackler, O.T., Murooka, T.T., Imle, A. and Mempel, T.R. (2014). Adding new dimensions: Towards an integrative understanding of HIV-1 spread. Nat. Rev. Microbiol., 12: 563-574)
Despite several decades of intense research efforts, the mechanisms underlying key events in AIDS pathogenesis such as the depletion of CD4+ T lymphocytes or the modes of virus transmission to individual target cells remain poorly understood. Most of our knowledge on the mechanistic and quantitative aspects of HIV-1 replication is deduced from experiments in monotypic cell cultures in which virus spread is facilitated by unnaturally high density of permissive and immobile target cells. More authentic organotypic ex vivo or in vivo models have been introduced to the HIV field, but only reflect select aspects of HIV biology and/or critical experimental parameters cannot be controlled. To close this gap, the long term goal of this project is to reconstitute ex vivo patho-physiological aspects of HIV-1 infection in target organs of AIDS patients. This will be attempted using 3D cultures amenable to systematic variation of biophysical parameters, modulation of their cell composition, and thus dissection of viral mechanisms that optimize spread. During the first funding period we will focus on T lymphocytes as HIV-1 target cells. To this end we recently established an ex vivo 3D culture system of T lymphocytes in collagen matrices as experimental system in which cell migration, HIV-1 replication, CD4+ T cell depletion, and viral cell-to-cell transmission can be visualised and quantified under controlled and changeable conditions. As an organotypic correlate for this synthetic approach, ex vivo cultures of human tonsil tissue are available in the laboratory. Finally, we recently established together with an external collaboration partner intravital imaging in mice to analyse the effect of individual HIV-1 proteins on T lymphocyte homing and intra lymph node motility.

The combination of these experimental approaches will allow us to characterise the parameters affecting HIV-1 spread in complex cell cultures systems and dissect viral mechanisms that optimise HIV-1 spread under varying physiological conditions. These goals will directly benefit from efforts by Lemke, Müller and Schultz to generate new tools for the visualisation of specific steps of HIV-1 replication. Iterative cycles of mathematical modeling and experimentation in collaboration with the Schwarz group will aid defining key parameters of the system. Central aspects of this funding period will be determining the relationship between T lymphocyte motility and HIV-1 spread in these 3D cultures and dissecting the relative contribution of cell-free and cell-cell transmission modes to HIV-1 spread and CD4+ T cell depletion. This will be studied in monotypic T lymphocyte cultures but also in presence of antigen presenting cells such as dendritic cells (together with Kräusslich) or B lymphocytes to study the impact of cell activation and immune recognition on these parameters. Finally, we aim at establishing in vivo analysis of T lymphocyte motility in mice under BSL-3 conditions as platform for future funding periods of this initiative. Following the initial characterization of key parameters in the first funding period, increasing emphasis will be on the impact of innate, cellular, and humoral immune responses in the system. Together, this will result in the generation of increasingly complex ex vivo models to mimic the situation in organotypic cultures as well as in vivo models of HIV-1 infection studied in parallel.

Trotz jahrzehntelanger intensiver Forschungsbemühungen bleiben grundlegende Mechanismen entscheidender Schritte der AIDS-Pathogenese unzulänglich verstanden, wie zum Beispiel die Depletion von CD4+ T-Lymphozyten oder die Art der Virusübertragung auf individuelle Zielzellen. Der Großteil unseres Wissens hinsichtlich der mechanistischen und quantitativen Aspekte der HIV-1-Replikation geht auf Experimente mit monotypischen Zellkulturen zurück, in denen die Virusausbreitung durch eine unnatürlich hohe Dichte an permissiven und immobilen Zielzellen erleichtert ist. Authentischere organtypische ex vivo oder in vivo Modelle wurden in die HIV-Forschung eingeführt, reflektieren jedoch nur ausgewählte Aspekte der HIV-Biologie und/oder kritische experimentelle Parameter können nicht kontrolliert werden. Um diese Lücke zu schließen, ist das langfristige Ziel dieses Projekts, pathophysiologische Aspekte der HIV-1-Infektion in Zielorganen von AIDS-Patienten ex vivo zu rekonstituieren. Dies soll mit Hilfe von 3D-Kulturen erreicht werden, welche für eine systemische Variation von biophysikalischen Parametern, für die Modulation ihrer Zellzusammensetzung und somit für die detaillierte Analyse von viralen Mechanismen, welche die Ausbreitung optimieren, zugänglich sind. Während der ersten Förderperiode werden wir den Schwerpunkt auf T-Lymphozyten als Zielzellen legen. Zu diesem Zweck haben wir kürzlich ein ex vivo 3D-Kultursystem von T-Lymphozyten in Kollagen-Matrices als experimentelles System entwickelt, in dem Zellmigration, HIV-1-Replikation, CD4+ T-Zell-Depletion und virale Zell-Zell-Übertragung unter kontrollierten und veränderbaren Bedingungen visualisiert und quantifiziert werden kann. Ex vivo Kulturen humaner Tonsillen sind als organtypisches Korrelat für diesen synthetischen Ansatz im Labor verfügbar. Schließlich haben wir kürzlich zusammen mit einem externen Kollaborationspartner ein intravitales Bildgebungsverfahren in Mäusen entwickelt, um den Effekt einzelner HIV-1-Proteine auf T-Lymphozyten-Homing und Lymphknoten-Motilität zu analysieren.

Die Kombination dieser experimentellen Ansätze wird es uns ermöglichen, die Parameter, welche die HIV-1-Ausbreitung in komplexen Zellkultursystemen beeinflussen, zu charakterisieren und virale Mechanismen, welche die HIV-1-Ausbreitung unter variierenden physiologischen Bedingungen optimieren, offen zu legen. Diese Ziele werden direkt von den Bestrebungen von Lemke, Müller und Schultz profitieren, neue Werkzeuge zur Visualisierung von spezifischen Schritten der HIV-1-Replikation zu generieren. Durch intensive Kollaboration mit der Arbeitsgruppe Schwarz werden iterative mathematische Modellberechnungen dazu beitragen, Schlüsselparameter des Systems zu definieren. Zentrale Aspekte dieser Förderperiode werden die Bestimmung der Beziehung zwischen T-Lymphozyten-Motilität und HIV-1-Ausbreitung in diesen 3D-Kulturen und die Aufschlüsselung des relativen Beitrags von zellfreier und zellassoziierter Übertragungsart zu HIV-1-Ausbreitung und CD4+ T-Zell-Depletion sein. Dies wird sowohl in monotypischen T-Zell-Kulturen, als auch in Anwesenheit von Antigen-präsentierenden Zellen, wie zum Beispiel dendritischen Zellen (zusammen mit Kräusslich) oder B-Lymphozyten, untersucht, um den Einfluss von Zellaktivierung und Immunerkennung auf diese Parameter zu bestimmen. Schlussendlich beabsichtigen wir, die in vivo Analyse von T-Lymphozyten-Motilität in Mäusen unter Biologischer Schutzstufe-3 (BSL-3)-Bedingungen zu etablieren, als Plattform für zukünftige Förderperioden dieser Initiative. Im Anschluss an die anfängliche Charakterisierung von Schlüsselparametern in der ersten Förderperiode wird eine steigende Gewichtung auf dem Einfluss von angeborener, zellulärer und humoraler Immunantwort im System liegen. Zusammen wird dies zur Etablierung von zunehmend komplexeren ex vivo Modellen führen, um die Situation in sowohl organtypischen Kulturen als auch in in vivo Modellen von HIV-1 Infektion, die parallel untersucht werden, zu imitieren.

Project Staff

Andrea Imle, PostDoc