The assembly and spread of influenza virus

Briggs, John
The European Molecular Biology Laboratory (EMBL)

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We aim to describe the assembly and spread of influenza virus in terms of structure and in terms of dynamics, primarily by the use of electron microscopy and fluorescence microscopy techniques. Influenza virus assembles enveloped virus particles that are typically round in cell culture, but filamentous in infected tissue. These particles bud from the surface of an infected cell, and are subsequently taken up by uninfected cells by endocytic mechanisms prior to fusion. The viral proteins hemagglutinin, neuraminidase, matrix protein 1 and matrix protein 2 all play roles in the assembly of a virus particle. Studies of the roles of these proteins using transfection to induce virus-like particle assembly, or using infectious virus, have so far failed to provide a definitive understanding of the roles and the interactions of individual proteins during the assembly process.

This project has three major aims:

Firstly we will use electron microscopy, electron tomography, cryo-electron tomography and image processing to study released virus-like particles produced using different combinations of viral proteins, released virions, and the surfaces of cells expressing viral proteins or infected by viral strains with different morphologies. Combining these data will allow us to describe how the expression of different combinations of viral proteins affects the morphology of assembly sites and released virus particles, and the arrangement and structure of the incorporated proteins. In this way we will reveal the roles played by the individual proteins during assembly.

Secondly, we will apply new fluorescent-labeling approaches to generate fluorescently tagged viral proteins and virus strains. We will use these to image the assembly and release processes by live-cell fluorescence microscopy. By combining the structural data from electron microscopy with the dynamic data from fluorescence microscopy we aim to derive a quantitative description of the virus assembly process and the roles played by individual proteins. This description should include not only a spatial description of the different stages in viral assembly, but a temporal description: how long the stages take, and which are rate limiting.

Thirdly, we will use correlative fluorescence and electron microscopy techniques to identify the location of sites where virus particles are being transferred between neighbouring cells, and to image those sites by electron tomography. We will particularly address the hypothesis that filamentous virus morphologies may have evolved to facilitate direct cell-cell transfer of virus. We will supplement these correlative microscopy observations by virological assays of viral spread to understand how virus particles are transferred between cells, and through a tissue, and whether the mode and rate of spread are dependent on virus morphology. To achieve these goals, we will collaborate with projects Lemke and Schultz on fluorescence labelling, project Krijnse-Locker/Briggs on correlative fluorescence and electron microscopy, and project Brügger/Kräusslich on the role of lipids in influenza virus assembly.


 

Wir beabsichtigen, die dem Aufbau und der Ausbreitung von Influenzaviren zugrunde liegenden Strukturen und Dynamiken mit Hilfe von Elektronen- und Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen. Influenza formt membranumhüllte Viruspartikel. In Zellkultur weisen diese eine rundliche Form, in infiziertem Gewebe jedoch eine filamentöse Struktur auf. Viruspartikel entstehen an der Membran von infizierten Zellen und schnüren sich auch dort von der Wirtszelle ab, bevor sie durch Endozytose neue Zellen infizieren. Die viralen Proteine Hämagglutinin, Neuraminidase, Matrixprotein 1 und Matrixprotein 2 sind dabei entscheidend am Aufbau neuer Viruspartikel beteiligt. Die Rolle der einzelnen Proteine im Aufbau neuer Viren konnte jedoch bisher weder durch Verwendung von infektiösen Viren, noch durch Transfektion von Zellen zur Erzeugung virusartige Partikel exakt definiert werden.

Das vorgeschlagene Projekt hat drei Ziele:

(i) Unter Zuhilfenahme von Elektronenmikroskopie, Elektronentomographie, Kryo-Elektronentomographie und Bilderverarbeitungstechniken werden wir virusartige Partikel – aufgebaut aus verschiedenen Kombinationen von Influenzaproteinen – aber auch die Zellen, die diese herstellen, untersuchen. Durch die gleiche Methodik werden auch die Unterschiede zwischen runden und filamentösen Viren untersucht werden. Eine Kombination dieser Daten wird uns erlauben zu beschreiben wie die Kombination von verschiedenen Influenzaproteinen die Virusmorphologie und die Anordnung der einzelnen Proteine beeinflusst. Somit wird sich die Rolle, welche die einzelnen Proteine im Aufbauprozess von Influenzavirus spielen, exakt definieren lassen.

(ii) Um den Aufbau- und Abschnürungsprozess von Influenzaviren in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie zu beobachten, werden wir eine neue Fluoreszenzmarkierungsmethode verwenden, die es erlaubt, verschiedene Influenzaproteine und Stämme mit Fluorophoren unserer Wahl zu markieren. Durch Kombination der auf Elektronenmikroskopie basierenden strukturellen Daten mit den dynamischen Daten der Fluoreszenzmikroskopie versuchen wir, den Prozess des Virusaufbaus und die Rolle der einzelnen Proteine quantitativ zu beschreiben. Solch eine Beschreibung soll dabei nicht nur die räumliche Verteilung der Proteine zu verschiedenen zeitlichen Stadien beschreiben, sondern auch, wie lange die verschiedenen Stadien andauern und welche den Aufbauprozess von Influenza zeitlich limitieren.

(iii) Wir werden korrelative Fluoreszenz-Elektronen-Mikroskopie verwenden, um Stellen zu identifizieren, an welchen Viren zwischen Zellen transferiert werden, und wir werden solche Stellen mit Elektronentomographie analysieren. Wir werden dabei spezifisch die Hypothese testen, ob filamentöse Viruspartikel dem Transfer des Virusgenoms zwischen Zellen dienlich sind. Wir werden die korrelativen Daten mit virologischen Studien komplementieren, welche die Verbreitung verschiedener Viren (rund, filamentös) zwischen Zellen, aber auch Geweben untersuchen, und feststellen, ob die Art und Geschwindigkeit der Ausbreitung zwischen diesen Influenzatypen variiert. Um diese Ziele zu erreichen, werden wir mit Lemke und Schultz die Fluoreszenzmarkierung entwickeln, mit Krijnse-Locker/Briggs die korrelative Fluoreszenz-Elektronen-Mikroskopie und mit Brügger/Kräusslich die Rolle von Lipiden im Aufbau von Influenzaviren untersuchen sowie Experimente mit infektiösen Influenzaviren durchführen.