Project Z02

Correlative light- and electron microscopy

New project leaders since January 2017

Dr. Yannick Schwab
The European Molecular Biology Laboratory (EMBL) Heidelberg

Dr. Charlotta Funaya
Electron Microscopy Core Facility (EMCF), University Heidelberg 

Dr. Yannick Schwab

Dr. Charlotta Funaya

News

January 1st, 2017 | Change of Project leaders

Dr. John Briggs

PD Dr. Jacomine Krijnse-Locker

This project was initially proposed and led by Dr. John Briggs and PD Dr. Jacomine Krijnse-Locker. Since both colleagues have recently moved to other institutions outside of Germany, the project is now led by Yannick Schwab and Charlotta Funaya.
The group of Jacomine Krijnse-Locker (Project leader until April 2015) is now located at Institut Pasteur in Paris, and the group of John Briggs (project leader until Dec. 2016) moved to the LMB Cambridge.

Introduction

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) is a set of techniques aiming at imaging the same object by both light and electron microscopy. This emerging field has many variants with a broad spectrum of application in Life Sciences. Interestingly, CLEM synergizes the power of both imaging modalities. Whilst light microscopy gives information about the molecular content of the cells in a dynamic and functional fashion, and at potentially high temporal resolution, electron microscopy opens access to the fine structure of the sub-cellular compartments. CLEM methods are particularly well suited to study host-pathogen interactions that entail many events that can be fluorescently tagged (LM) and then further characterized ultra-structurally (EM).

The aim of the Z2-project is to implement, adapt and develop CLEM applications to support various projects of this SFB network. During the first period of the SFB 1129 project two CLEM methods have been successfully implemented and used in the SFB projects. The first one, live-cell imaging CLEM, involves selecting phenotypic cells by live cell imaging and analyzing them in TEM. This method has become widely used to localize virus replication sites in the project of Bartenschlager (figure 1). With on-section CLEM, the second method implemented, the signal from genetically encoded fluorescent proteins is preserved during the sample preparation for EM. Resin sections are screened by light microscopy to localize the position of the fluorescence with high precision, which is then registered to the corresponding TEM images. Fine ultrastructure is thus precisely associated with the site of expression of a tagged protein. This technique initially developed in the Briggs group at EMBL is now used for studying HIV-1 infection in the group of Kräusslich. We aim to further make use of these methods in other SFB projects also in more complex systems and to work on automating the LM and EM acquisition and registration.

The current challenge is to propose new CLEM approaches. Live cell imaging of cultured cells will be combined with TEM and FIBSEM tomography within the projects of Kräusslich, Müller and Bartenschlager. New automated CLEM platforms enabling phenotypic screens at the ultrastructural level will be implemented in collaboration with the Bartenschlager group. Finally, intravital CLEM methods, particularly relevant for studying host-pathogen interactions in murine models, will be explored with the groups of Fackler, Frischknecht and Lanzer. Further collaborations with Kräusslich, Fackler, Müller (HIV-1 entry, budding and spread), Frischknecht/Spatz (actin dynamics in Plasmodium sporozoites),  and Boulant (enterovirus entry) will expand the fields of application of the various CLEM methods. Given the large number of collaborative projects within this Z-project the prospect is to develop robust protocols for CLEM that will be beneficial to the entire SFB-network and beyond.


Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) zielt darauf ab dasselbe Objekt sowohl mit der Lichtmikroskopie als auch mit der Elektronenmikroskopie abzubilden. Inzwischen existieren verschiedenste Formen dieser Techniken, die in vielen Bereichen der Lebenswissenschaften Anwendung finden. Hierbei vermittelt CLEM eine Synergie wobei die Stärken beider Modalitäten kombiniert werden. Auf diese Weise können im Lichtmikroskop Informationen über die molekulare Zusammensetzung von Zellen in einer dynamischen und funktionellen Art und Weise gesammelt werden, und dies auch mit hoher zeitlicher Auflösung. Die Elektronenmikroskopie wiederum eröffnet die Möglichkeit feinste Strukturen der subzellulären Kompartimente sichtbar zu machen. CLEM Methoden sind besonders gut dafür geeignet die Wirt-Pathogen-Interaktionen zu studieren, wobei dafür viele Ereignisse fluoreszent markiert werden müssen (LM) und dann weiter auf Ultrastrukturebene analysiert werden können (EM).

Das Ziel des Z2-Projektes ist es korrelative Techniken für die Arbeitsgruppen des SFB nutzbar zu machen und ihre Entwicklung voranzutreiben. Während des ersten Antragszeitraumes des SFB1129 konnten mit Hilfe des Z2 Projektes zwei solche korrelativen Techniken etabliert werden und in den SFB Projekten genutzt werden. Im ersten Fall folgt der phänotypischen Selektion auf lichtmikroskopischer Ebene an lebenden Zellen die ultrastrukturelle Charakterisierung der identifizierten Zellen mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Technik wird inzwischen häufig z. B. im Projekt der Bartenschlager-Gruppe (Abbildung 1) benutzt um Stätten viraler Replikation zu lokalisieren. Ebenfalls implementiert werden konnte die korrelative Mikroskopie auf Dünnschnitten, wobei es gelingt während der Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie die in den Zellen enthaltenen fluoreszierenden Markermoleküle zu erhalten. Die Harz-Dünnschnitte werden mit Hilfe eines Lichtmikroskops geprüft, um die Position der Fluoreszenzmarkierung mit hoher Präzision zu lokalisieren, was dann mit dem korrespondierenden TEM Bildern registriert wird. Feinste Strukturen können somit sehr präzise mit der Expressionsstelle des markierten Proteins assoziiert werden. Diese ursprünglich von der Briggs-Gruppe am EMBL Heidelberg entwickelte Technik wird mittlerweile auch von der Kräusslich-Gruppe zur Untersuchung der HIV-1 Infektion erfolgreich angewandt. Unser Ziel ist es die erprobten Methoden in anderen SFB Projekten anzuwenden und weitere neue korrelative Methoden in komplexeren Systemen, die einen höheren Grad an Automatisierung erfordern, zu entwickeln.

Die jetzige Herausforderung ist es neue CLEM Verfahren zu entwickeln. Die Mikroskopie lebender Zellen wird mit TEM Tomographie und FIBSEM Bildgebung in den Projekten der Gruppen Kräusslich, Müller und Bartenschlager kombiniert. Neue automatisierte CLEM Systeme die phänotypische Screens auf ultrastrukturellen Niveau möglich machen werden in den Kooperationen mit der Bartenschlager Gruppe implementiert. Und schließlich sind intravitale CLEM Methoden besonders relevant, um die Wirt-Pathogen-Interaktion vor allem am Mausmodell in den Gruppen Fackler, Frischknecht und Lanzer zu testen. Fernergibt es Kollaborationen mit den Gruppen Kräusslich, Fackler, Müller (HIV-1 Eindringen, Budding und Ausbreitung), Frischknecht/Spatz (Aktin Dynamik in Plasmodium sporozoites) und Boulant (Enterovirus Eindringen) dienen dazu mit Hilfe von CLEM neue Möglichkeiten in den entsprechenden Forschungsfeldern zu generieren und wichtige Fragen zu klären. Aufgrund der Vielzahl verschiedenster kollaborativer Forschungsansätze innerhalb des z-Projektes und der bereits gemachten Fortschritte sehen wir gute Chancen auch weiterhin einen wertvollen Beitrag zum SFB und darüber hinaus für die Weiterentwicklung korrelativer licht- und elektronenmikroskopischer Techniken zu leisten.

Correlative light and electron microscopy of human hepatoma cells expressing a GFP-tagged viral protein (green). The distribution of the EGFP-tagged protein, the cellular lipid droplets (red) and the nucleus (blue) were recorded by light microscopy (LM). Samples were then processed for transmission electron microscopy (EM) (gray). Correlation of the two datasets (LM and EM, left panel) allowed identification of the ultrastructural details of the alterations induced by viral protein expression. (Mirko Cortese and Volker Lohmann)