Loading...

Project 11

Spatial and temporal coordination of RNA translation, replication and assembly in a membranous plus-strand RNA virus replication factory

Bartenschlager, Ralf
Dept. of Infectious Diseases – Molecular Virology

Rohr, Karl
Dept. Bioinformatics and Functional Genomics

 

News

Information

Viral infections are a major cause of disease, with enormous costs resulting from morbidity/mortality and economic losses worldwide. Plus-strand RNA viruses encompass a large group that includes several medically highly relevant pathogens including hepatitis C virus (HCV), Dengue virus (DENV), West Nile virus (WNV), Tick-borne encephalitis virus (TBEV), entero- and coronaviruses. Productive replication of these viruses requires the formation of a cytoplasmic membranous replication factory that is induced by remodeling of intracellular membranes of the infected host cell. Based on the morphology of the membranous factories two different types are observed: (a) a factory composed primarily of double membrane vesicles or (b) formed by invagination of membranes into intracellular compartments. These morphotypes do not follow the phylogeny of the different virus groups but likely reflect the analogous use of cellular pathways and machineries. By using two plus-strand RNA viruses inducing either morphotype of the membranous replication factory, we aim to decipher the general principles of plus-strand RNA virus replication. This information might guide the development of novel broad-spectrum antiviral concepts targeting the biogenesis and functionality of membranous replication factories induced by this medically highly relevant virus group.

 


Viren sind eine bedeutsame Ursache für Infektionskrankheiten, die sehr hohe Kosten für das Gesundheitssystem sowie erhebliche wirtschaftliche Einbußen verursachen können. Plus-Strang RNA Viren sind eine große Gruppe von Erregern, zu denen beispielswiese das Hepatitis C Virus (HCV), das Dengue Virus (DENV), der Erreger der Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME) sowie Entero- und Coronaviren gehören, die von hoher medizinischer Relevanz sind und die größere Epidemien oder gar Pandemien verursachen können. Voraussetzung für die produktive Vermehrung (Replikation) dieser Viren ist die Ausbildung viraler Replikationsfabriken, deren wesentlicher Bestandteil intrazelluläre Membranen der infizierten Wirtszelle sind. Auf Grund der Morphologie der rearrangierten Membranen lassen sich zwei Typen unterscheiden: (a) Replikationsfabriken, die vorwiegend aus „Doppelmembranvesikeln bestehen und (b) Fabriken, die sich durch Einstülpungen in intrazelluläre Kompartimente bilden. Diese Morphotypen folgen überraschenderweise nicht der Taxonomie der Viren, spiegeln aber sehr wahrscheinlich die Aktivierung analoger zellulärer Prozesse wieder, die sich die jeweiligen Viren zu Nutze machen. Durch vergleichende Analyse zweier Viren, die jeweils einen der beiden Morphotypen der membranösen Replikationsfabriken induzieren wollen wir allgemeingültige Prinzipien der Replikationszyklen von Plusstrang RNA Viren identifizieren. Mit Hilfe dieser Information sollen zelluläre Faktoren und Prozesse identifiziert werden, die von bestimmten Virusgruppen gemeinsam genutzt werden, um somit Angriffsziele für die Entwicklung von Breitband-Virostatika zu definieren, die an der Biogenese und Funktionalität der Replikationsfabriken von Plusstrang RNA Viren angreifen.

 

3D reconstruction of HCV-, DENV- and TBEV-induced membrane alterations (adapted from Romero-Brey et al., 2012; Welsch et al., 2009; Miorin et al., 2012).

Plus-strand RNA viruses are a group of medically highly relevant viruses including hepatitis C virus (HCV), Dengue virus (DENV), Tick-borne encephalitis virus (TBEV), entero- and coronaviruses. Productive replication of these viruses requires the formation of a cytoplasmatic membranous replication factory that is formed by remodelling of intracellular membranes. We have recently shown that membrane alterations induced by HCV (called the membranous web) are distinct from those of the closely related DENV and very much resemble the ones described for the distantly related entero- and coronaviruses. In fact, these viruses correspond to the double membrane vesicle morphotype, whereas the structures induced by DENV or TBEV correspond to the invaginated vesicles morphotype. In addition, we found that HCV assembly initiates in close proximity of lipid droplets (LDs), which are organelles where the capsid protein and the NS5A replicase factor accumulate.

Based on these morphological studies, and by analogy to DENV, we propose that distinct subcompartments within the membranous web exist where RNA translation, RNA replication and virus assembly occur. Moreover, since these three processes are mutually exclusive, regulatory mechanisms must exist to allow their coordination. In the present project, we want to validate and extend this model by studying three complementary aspects.

The first aspect addresses the molecular mechanisms underlying biogenesis of the membranous HCV replication factory and its detailed 3D architecture. The second aspect deals with the identification of functional subcompartments within this membranous web, i.e. the sites of viral RNA translation, RNA replication and virion assembly. The third aspect aims to determine the molecular mechanisms underlying the spatial and temporal coordination of the different steps of the viral replication cycle within and between these subcompartments. This most likely involves active transport processes by which viral cargo, presumably in complex with host cell factors, is transferred between these subsites. In addition, temporal regulatory mechanisms might play a role, e.g., by the time-dependent accumulation or modification of certain viral proteins (e.g., core and NS5A). We will utilize and adopt already established light and electron microscopy-based methods, including electron tomography (ET) to determine the 3D architecture of virus-induced membranous structures, super-resolution light microscopy and correlative light-electron microscopy to identify the sites of RNA translation, replication and assembly, and live cell imaging to study the dynamics of transport processes between these sites at the single cell level.

These methods require development of new and adaptation of existing image analysis methods that will be established within this project, but are essential techniques that will be utilized also by several other projects within this SFB (e.g., Müller, Fackler, Ruggieri and Urban). While studies during the initial funding period are based on Huh7 hepatoma cells that are most permissive for HCV, our midterm goal is to apply this knowledge to the studies in more authentic cell culture models, ideally primary cells as well as co-culture systems. An additional long-term goal is to conduct comparative analyses with DENV to identify more general principles of the replication cycle of plus-strand RNA viruses. By using two plus-strand RNA viruses inducing either morphotype of the membranous replication factory, likely reflecting alternative strategies to coordinate the different steps of the viral replication cycle, we should be able to decipher more general principles of plus-strand RNA virus replication. This information might guide the development of novel broad-spectrum antiviral concepts targeting the biogenesis and functionality of membranous replication factories induced by this medically highly relevant virus group. Our recent studies of HCV NS5A-targeting drugs demonstrating complete inhibition of membranous web formation support this promise.

 

 

Plus-Strang RNA Viren, wie etwa das Hepatitis C Virus (HCV), das Dengue Virus (DENV), das Tick-borne Encephalitis Virus (TBEV), Entero- und Coronaviren, sind medizinisch hoch relevant. Voraussetzung für die produktive Replikation dieser Viren ist die Ausbildung viraler Replikationsfabriken, deren wesentlicher Bestandteil intrazelluläre zytoplasmatische Membranen sind. Wir konnten kürzlich zeigen, dass Membranveränderungen, die durch HCV induziert werden (membranous web) sich von denen des nah verwandten DENV unterscheiden und den Membranveränderungen der entfernt verwandten Entero- und Coronaviren ähneln. Tatsächlich induzieren diese Viren einen „double membrane vesicle“ Morphotyp, während die Strukturen, die durch DENV und TBEV induziert werden, dem „invaginated vesicle“ Morphotyp zugeordnet werden können. Weiterhin konnten wir zeigen, dass der Zusammenbau neuer HCV Partikel in enger Nachbarschaft von Lipidtröpfchen (LDs) stattfindet und sich dort das virale Kapsidprotein und der Replikasefaktor NS5A anhäufen.

Basierend auf diesen morphologischen Studien und in Analogie zu DENV schlagen wir ein Modell vor, in dem funktionale Sub-Kompartimente für RNA Translation, RNA Replikation und die Virusmontage innerhalb des „membranous web“ existieren. Da sich diese Prozesse gegenseitig ausschließen, müssen regulatorische Mechanismen zu deren Koordination existieren. In diesem Projekt möchten wir das aufgestellte Modell überprüfen und drei komplementäre Teilprojekte untersuchen.

Das erste adressiert die molekularen Mechanismen, die der Biogenese der membranösen HCV Replikationsfabriken zugrunde liegen sowie deren detaillierte 3D Architektur. Das zweite Teilprojekt beschäftigt sich mit der Identifikation der drei genannten Sub-Kompartimente innerhalb des „membranous web“. Der dritte Teilaspekt hat zum Ziel, die molekularen Mechanismen zu bestimmen, die der zeitlichen und räumlichen Koordination der verschiedenen Schritte des viralen Replikationszyklus zwischen und innerhalb der einzelnen Sub-Kompartimente zu Grunde liegen. Höchstwahrscheinlich sind aktive Transportprozesse involviert, durch die die viralen Faktoren – vermutlich in Assoziation mit zellulären Faktoren – zwischen den unterschiedlichen Sub-Kompartimenten transportiert werden. Zusätzlich könnten auch zeitlich regulierte Mechanismen eine Rolle spielen, z.B. durch die zeitabhängige Akkumulation oder Modifikation verschiedener viraler Proteine (z.B. Core und NS5A). Wir werden bereits etablierte licht- und elektronenmikroskopische Methoden, einschließlich der Elektronentomographie (ET), einsetzen, um die 3D Struktur der virus-induzierten Membranstrukturen zu eruieren, hochauflösende Lichtmikroskopie und korrelative Licht-Elektronen-Mikroskopie, um die Orte der RNA Translation, Replikation und der Virusmontage zu identifizieren und Lebendzellmikroskopie, um die Dynamik der Transportprozesse zwischen den einzelnen Orten auf Einzelzellniveau zu studieren.

Diese Methoden erfordern die Entwicklung neuer sowie die Anpassung bereits existierender Bildanalyseverfahren, die zwar innerhalb dieses Projekts etabliert werden, aber essentiell für zahlreiche andere Projekten innerhalb des SFBs sind und dort eingesetzt werden (z.B. Müller, Fackler, Ruggieri und Urban). Während die Studien innerhalb der ersten Förderperiode auf der humanen Hepatomzelllinie Huh7 basieren, die hoch-permissiv für HCV ist, haben wir mittelfristig zum Ziel, das erhaltene Wissen auf authentischere Zellkulturmodelle, idealerweise primäre Hepatozyten und Ko-Kulturmodelle, anzuwenden. Langfristig wollen wir vergleichende Analysen mit DENV durchführen, um allgemeingültige Prinzipien in den Replikationszyklen von Plusstrang RNA Viren identifizieren zu können. Dies sollte durch die Verwendung zweier Viren, die jeweils einen der beiden Morphotypen der membranösen Replikationsfabriken induzieren und somit vermutlich alternative Strategien widerspiegeln, wie verschiedenen Schritte des viralen Replikationszyklus koordiniert werden, möglich sein. Mit Hilfe dieser Information sollen dann Breitband-Virostatika entwickelt werden, die die Biogenese und Funktionalität der Replikationskomplexe von Plusstrang RNA Viren hemmen. Neuere Untersuchungen von uns unterstützen diese Hoffnung, da wir mit antiviralen Substanzen, die gegen das HCV NS5A gerichtet sind, eine komplette Inhibition der Biogenese des „membranous web“ nachweisen konnten.

Project Staff

Olga Oleksiuk, PostDoc

Ina Karen Stoeck, PhD