Impact of virus-induced oscillating stress response on host cell homeostasis
Accumulation of viral products such as RNA replication intermediates and viral proteins represents a potential stressor for host cells. Rapidly after detection, host cells respond by implementing multiple appropriated defense mechanisms, including innate immune and stress responses. The strongest response to several forms of stress, including viral infections, is a global reduction of protein synthesis which promotes cellular survival. Translation suppression is induced by the phosphorylation of the alpha subunit of the eukaryotic translation initiation factor-2 (eIF2α), thereby causing stalling of translation initiation and accumulation of stalled pre-initiation complexes in cytosolic stress granules (SGs). Viruses do not package ribosomes and therefore fully rely on the utilization of the host translation machinery to ensure viral protein synthesis, replication and virus progeny production. As a consequence, virus survival depends on the establishment of a delicate and fine-tuned balance between host translation repressions that results from stress response induction, efficient virus genome translation and maintenance of host homeostasis. A number of viruses appear to antagonize SG formation during infection, although some may exploit SG responses for their replication. In our previous work, we showed that chronic infections such as those caused by the hepatitis C virus (HCV), a major causative agent of chronic liver diseases, modulate cellular stress response to allow long-term viral replication and cell survival. Using long term live-cell imaging microscopy, we showed that HCV infection in combination with type 1 interferon (IFN) treatment induces a dynamic and oscillating host cell stress response that can be visualized by cycles of assembly/disassembly of SGs, concomitant with phases of active and stalled translation. These oscillations are controlled by the antagonistic action of protein kinase R, an IFN-induced eIF2α kinase which senses double-stranded RNA and phosphorylates eIF2α and Growth Arrest and DNA-damage-inducible 34, a regulatory subunit of protein phosphatase 1 which allows a rapid dephosphorylation of eIF2α. Importantly, oscillating stress response is a conserved host cell reaction to various single-stranded RNA virus infections, nonetheless, with SG oscillation frequencies unique to each virus. In the case of cell infected with HCV in presence of IFN-α, these SG oscillations prolong cell survival by avoiding extended phases of protein synthesis shut-off suggesting that HCV may exploit the cellular stress response to establish persistence.
Although, the role of SGs in virus infection is now being increasingly recognized, their impact on virus spread and viral mechanisms of SG manipulation remain largely elusive. Moreover, preliminary results strongly suggest that the regulation of SG oscillation is far more complex than currently appreciated. The long term goal of this proposal is to provide a dynamic and comprehensive picture of the balance established between host responses and efficient virus replication and spread in complex cell systems. During the first funding period, we will start with cell culture monolayers to address how the two major human pathogens HCV and Dengue virus impact on virus-induced oscillating stress responses to establish this balance. In the first part, we will combine time-resolved and quantitative approaches to identify and characterize new cellular and viral parameters that affect the magnitude and dynamics of cellular stress response to virus infection. Detailed quantifications of SG interactions with sub-cellular compartments, and kinetics of SG triggering mechanisms and virus-induced immune response establishment rely on essential collaborations with the groups of Rohr and Schultz. Resulting dynamic information will be included in a quantitative mathematical modeling of SG oscillations in response to virus infection. In the second part of this proposal, we will investigate how virus-induced oscillating stress responses influence two stress-associated biological processes. In a first approach, we will generate a genome-wide time-resolved map of host translational changes that happen in the course of infection and characterize virus strategies to subvert the translation machinery. In a second approach, in close collaboration with the group of Bartenschlager, we will investigate the impact of the sequestration of innate immune components into SGs on the kinetics of the virus-induced immune response establishment. The parallel development of hepatocyte-derived 3D cultures within the consortium will increasingly allow us to validate our findings in the context of complex cell organization.
Die Akkumulation viraler Produkte wie RNA-Replikationszwischenprodukte und Proteine stellt einen potenziellen Stressor für Wirtszellen dar. Die Erkennung dieser Strukturen führt zur Implementierung vielfältiger Abwehrmechanismen wie der angeborenen Immun- und Stressantwort. Die dominanteste Antwort auf verschiedene Formen von Stress, einschließlich viraler Infektionen, ist die Unterdrückung der globalen Proteinsynthese. Diese Reduktion ist förderlich für das Überleben der infizierten Wirtszelle. Sie wird durch die Phosphorylierung der Alpha-Untereinheit des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2 (eIF2α) induziert und führt zur Blockade der Translationsinitiation und zur Akkumulation von arretierten Präinitiationskomplexen in cytosolischen Stress-Granula (SGs). Viren besitzen keine eigene Translationsmaschinerie und sind somit ganz auf die Nutzung des Translationsapparates der infizierten Wirtszelle angewiesen, um virale Proteinsynthese, Replikation und Produktion von Viruspartikeln zu sichern. Folglich hängt der erfolgreiche Replikationszyklus des Virus von der fein eingestellten Balance zwischen Translationsunterdrückung als Ergebnis der Induktion der Stressantwort, effizienter Translation des Virusgenoms und Erhaltung der Wirtshomöostase ab. Viele Viren wirken der Formation von SGs entgegen, obwohl einige davon sogar die Induktion der SGs zur eigenen Replikation nutzen. In unserer bisherigen Arbeit konnten wir zeigen, dass chronische Leberinfektionen, wie sie durch das Hepatitis- C Virus (HCV) verursacht werden, die zelluläre Stress-Antwort modulieren. Diese Veränderungen ermöglichen das Überleben der infizierten Zellen jedoch auch langfristige virale Replikation. Durch die Visualisierung von Zyklen aus Bildung und Abbau von SGs mit Hilfe von „long-term live-cell microscopy“ konnten wir zudem darstellen, dass die Kombination von HCV-Infektion und Behandlung mit Typ-1 Interferon (IFN) eine dynamische und oszillierende Stressantwort der Wirtszelle induziert. Die beobachteten Zyklen korrelieren mit Phasen der aktiven und arretierten Translation. Sie werden durch die antagonistische Wirkung zweier Proteine ausgelöst, die den Phosphorylierungsstatus von eIF2α regulieren. Nach Detektion doppelsträngiger RNA phosphoryliert die IFN-induzierte Protein Kinase R eIF2α, wohingegen Growth Arrest und DNA-damage-inducible 34, eine regulatorische Untereinheit der Proteinphosphatase 1, eine schnelle Dephosphorylierung ermöglicht. Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, dass eine oszillierende Stressantwort eine konservierte Wirtszellreaktion auf verschiedenste Infektionen mit Einzelstrang-RNA-Viren darstellt, jedoch die Frequenz der Oszillation einzigartig für jeden Virustyp ist. Durch die geringe Dauer von Phasen der Translationsinhibition im Falle einer HCV-Infektion, die mit IFN behandelt wird, verlängert die spezifische Frequenz der Oszillation das Überleben der Zelle aber auch des Virus. Somit liegt es nahe, dass HCV die zelluläre Stressantwort nutzt um eine Persistenz zu schaffen.
Obwohl die Rolle von SGs bei viraler Infektion nun zunehmend erkannt wird, bleiben ihre Auswirkungen auf die Verbreitung des Virus sowie virale Mechanismen der SG-Manipulation weitgehend ungeklärt. Vorläufige Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass die Regulierung der SG-Oszillierung weitaus komplexer ist als derzeit angenommen. Das langfristige Ziel dieses Antrags ist es, ein dynamisches und umfangreiches Bild der Balance zwischen Wirtsantwort und effizienter Replikation und Verbreitung von Viren in komplexen Zellsystemen herzustellen. Während der ersten Förderperiode werden wir in Zellkultur den Einfluss von HCV und Dengue Virus auf die Etablierung des Gleichgewichts der Virus-induzierten oszillierenden Stressantwort untersuchen. Wir kombinieren im ersten Abschnitt zeitaufgelöste und quantitative Ansätze, die zur Identifizierung und Charakterisierung von neuen zellulären und viralen Parametern, die die Stärke und Dynamik der zellulären Stressantwort auf Virusinfektionen beeinflussen, dienen. Eine detaillierte Quantifizierung von Interaktionen zwischen SGs und subzellulären Kompartimenten sowie der Kinetik der SG auslösenden Mechanismen mit der Etablierung der Virus-induzierten Immunantwort stützt sich auf wichtige Kooperationen mit den Gruppen Rohr und Schultz. Die gewonnenen dynamischen Informationen werden des Weiteren zu einer quantitativen mathematischen Modellierung der SG Oszillierung in Reaktion auf Virusinfektionen benutzt werden. Im zweiten Teil dieses Antrags werden wir untersuchen, wie die Virus-induzierte oszillierende Stressantwort zwei Stress-assoziierte biologische Prozesse beeinflusst. In einem ersten Ansatz werden wir eine genomweite zeitaufgelöste Karte von translationalen Veränderungen der Wirtszelle, die sich im Verlauf der Infektion entwickeln, erzeugen. Zudem werden wir Virusstrategien charakterisieren, die der Subversion der Translationsmaschinerie dienen. In einem zweiten Ansatz, der in enger Zusammenarbeit mit Bartenschlager abläuft, werden wir die Auswirkungen der Sequestrierung von Komponenten des angeborenen Immunsystems in SGs auf die Kinetik der Etablierung der Virus-induzierten Immunantwort untersuchen. Die parallele Entwicklung von Hepatozyten-abgeleiteten 3D-Kulturen innerhalb des Konsortiums wird uns zunehmend ermöglichen, unsere Ergebnisse im Rahmen von komplexer Zellorganisation zu validieren.