Chemical biology tools for infectious diseases research
Schultz, Carsten
The European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
The Schultz group will add chemical expertise and tool development to the consortium. The tools provided will help understanding pathogen-host interactions as well as pathogen lifecycles. Specifically, we will prepare artificial amino acids and photostable membrane-permeant dyes for non-disruptive labeling of proteins in intact pathogens and host cells. We will apply new methods to cross-link interacting proteins inside cells. We will provide photoactivatable lipids to manipulate host membranes. Finally, we will provide fluorescent reporters for monitoring relevant enzyme activities. All tools will be applied in close collaboration with other groups from the consortium including Brügger, Müller, Ruggieri, Kräusslich, Lemke, Briggs, Fackler, Urban. Specifically, we will help to visualize rare molecules such as viral particles or dsRNA by helping other consortium members tagging them with dyes suitable for single molecule microscopy (Lemke, Kräusslich) or correlative electron microscopy (Briggs) to achieve maximal resolution. For that purpose, we will synthesize highly photostable sulfonated dyes in a bioactivatable form (prodrug type). This means the masked dyes are sufficiently lipophilic to pass membranes but once inside cells endogenous enzymes of the host cell will remove masking groups from the sulfonated dyes trapping them in the cytosol. Another way of tracking molecules is not by their presence but by their activity. We will produce sensors and reporters to monitor the enzyme activity of HIV enzymes as well as activated enzymes of the host cells. The idea is that the enzymes like HIV protease produce a signal in a non-reversible fashion that allows monitoring accumulated enzyme activity over time. This might be particularly useful to follow the spread of an HIV infection (with Müller, Kräusslich), potentially even in a complex 3D model (Fackler). This project is based on our strong expertise on preparing small molecule-based FRET reporters for protease activity. Further, we will prepare genetically encoded FRET sensors for measuring RNA-dependent protein kinase (PKR) activity in HCV-infected versus non-infected cells (with Ruggieri). For PKR we will also develop a method to artificially induce subunit dimerization by a rapamycin-based system in the absence of dsRNA, another tool to investigate PKR activity as part of the host cell defense. Finally, we will use a protein-protein cross-linking system recently developed in our lab that permits the covalent coupling of two PKR monomers after dimerization. As this is conditionally reversible by adding a small molecule, we might have temporal control over the enzyme activity (with Ruggieri).
Apart from the detailed projects, the Schultz group will be open to meet upcoming needs from the consortium members, be it in the field of lipid or amino acid chemistry, fluorescent probes or tools to manipulate or monitor protein-protein interactions. A good example is extracellular protease activity on the Plasmodium sporozoite (Frischknecht).
Die Schultz-Gruppe stellt dem Konsortium chemische Expertise und die Entwicklung von molekularen Werkzeugen zur Verfügung. Diese Werkzeuge werden helfen, Pathogen-Wirt-Interaktionen sowie die Lebenszyklen von Pathogenen besser zu verstehen. Insbesondere werden wir artifizielle Aminosäuren sowie photostabile Membran-gängige Farbstoffe herstellen, um Proteine nicht-invasiv in intakten Pathogenen und Wirtzellen zu markieren. Wir werden neue Methoden entwickeln, um Proteine in Wirtsmembranen zu steuern. Ferner werden wir fluoreszente Reportermoleküle zur Verfuegung stellen, um relevante Enzymaktivitäten verfolgen zu können. Alle Werkzeuge werde in enger Kooperation mit anderen Gruppen des Konsortiums (Brügger, Müller, Ruggieri, Kräusslich, Lemke, Briggs, Fackler, Urban und Frischknecht) eingesetzt werden. Insbesondere werden wir helfen, seltene Moleküle wie virale Partikel oder dsRNA sichtbar zu machen, in dem wir die einschlägigen Gruppen unterstützen, diese Moleküle mit Farbstoffen für die Einzelmolekülspektroskopie (Lemke, Kräusslich) oder korrelative Elektronenmikroskopie (Briggs) zu versehen, um maximale Auflösungen zu erhalten. Zu diesem Zweck werden wir hoch photostabile sulfonierte Farbstoffe in einer bioverfügbaren Form (prodrug Typ) herstellen. Dies bedeutet, dass die maskierten Farbstoffe ausreichend lipophil sind, um Membranen zu passieren, aber im Inneren der Zelle von endogenen Enzymen des Wirts von den Maskierungsgruppen befreit werden und daher im Cytosol verbleiben, wo sie zur Markierung von Zielmolekülen zur Verfügung stehen. Eine weitere Methode, Moleküle zu verfolgen, basiert auf ihren Aktivitäten. Wir werden fluoreszente Sensoren und Reporter herstellen, um HIV- und Wirtsenzymaktivitäten zu messen. Hier ist die Idee, dass Enzyme wie die HIV-Protease ein irreversibles Signal produzieren, dass auch geringe Aktivitäten akkumuliert über die Zeit messbar macht. Dies sollte es erlauben, die Ausbreitung einer HIV-Infektion messen zu können (mit Müller, Kräusslich), ggf. sogar in einem 3D-Zellmodell (Fackler). Dieses Projekt basiert auf unserer großen Erfahrung in der Synthese von FRET-Reportern zur Messung von Proteaseaktivitäten, die aus kleinen Molekülen aufgebaut sind. Ferner werden wir genetisch kodierte FRET-Sensoren herstellen, um die Aktivität der RNA-abhängigen Proteinkinase (PKR) in HCV-infizierten Zellen zu messen (mit Ruggieri). Für PKR werden wir außerdem ein Rapamycin-basiertes Werkzeug entwickeln, um künstlich Untereinheiten in Abwesenheit von dsRNA dimerisieren zu können. Dies wird helfen, PKR als Teil der Wirtzellverteidigung zu untersuchen. Schließlich werden wir ein Protein-Protein-Verknüpfungssystem anwenden, das kürzlich in unserem Labor entwickelt wurde. Es erlaubt die Verknüpfung zweier Untereinheiten, sofern die beiden Komponenten tatsächlich interagieren. Das System kann daher zu diagnostischen Zwecken verwendet werden. Da diese Verknüpfung durch Zugabe eines kleinen Moleküls gelöst werden kann, können wir ggf. PKR Aktivität zeitlich aufgelöst kontrollieren (mit Ruggieri).
Abgesehen von den einzelnen Projektteilen, wird die Arbeitsgruppe Anlaufstelle für alle SFB-Mitglieder sein, wenn es um Lipid- oder Aminosäurechemie, fluoreszente Proben oder Werkzeuge zur Manipulation oder Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen geht. Ein gutes Beispiel ist die extrazelluläre Proteaseaktivität von Plasmodium Sporozoiten (Frischknecht).