Project description 2nd funding period

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) is a set of techniques combining the advantages of fluorescent imaging (high throughput, functional analysis, molecular identification), with the benefits of electron microscopy (high resolution of sub-cellular architecture). Method and tool development in CLEM over the last decade have yielded a plethora of solutions for the scientific community to address challenging structure-function questions on a large variety of biological models. CLEM methods are particularly well suited to study host-pathogen interactions that entail many events that can be fluorescently tagged and analysed by light microscopy (LM) and then further characterized ultra-structurally by electron microscopy (EM).
The aim of the Z2-project is to implement, adapt and develop CLEM applications to support various projects of this SFB network. During the first period of the SFB 1129 project two CLEM methods have been successfully implemented and used. The first one, live-cell imaging CLEM, involves selecting phenotypic cells by live cell imaging and finding back and analyzing the same cells by EM. This method has been used to localize virus replication sites in the project of Bartenschlager (figure 1). In the second implemented method, high accuracy on-section CLEM, the signal from genetically encoded fluorescent proteins is preserved during the sample preparation for EM. Resin sections are then screened by light microscopy to localize the position of the fluorescence with high precision, which is then registered to the corresponding TEM images. Fine ultrastructure is thus precisely associated with the site of expression of a tagged protein. This technique initially developed in the Briggs group at EMBL is used within SFB1129 to localize proteins associated with the HIV-1 virion and thereby localizing the HIV particles within cells in the group of Kräusslich.

We aim to further make use of these implemented CLEM methods (live cell CLEM and on section CLEM) in other SFB projects. Hereby, we aim to adapt them to more complex systems as well as to specific models utilized to study host pathogen interactions. In this context new labelling methods and their suitability for the CLEM workflows will be tested together with the groups Urban/Grimm, Lusic/Beck and Cavalcanti-Adam/Spatz. We will also work on improving the ease of working with on section CLEM by increasing the automation in LM and EM acquisition and registration.

In addition, we plan to work on implementing new CLEM methods in collaboration with SFB1129 groups: 1) The combination of live cell CLEM with cryo-fixation methods and with 3D EM analyses (Kräusslich and Bartenschlager); 2) CLEM automatization to enable phenotypic screens at the ultrastructural level (Bartenschlager and Hamprecht/Rohr); 3) 3D CLEM on multicellular samples to efficiently link fluorescence imaging of complex models with targeted EM (Kräusslich, Fackler, Boulant); 4) Considering the recent developments in cryo-EM and its potential to bridge structural and cell biology, efforts will be made to explore how state of the art cryo-CLEM can be implemented in a facility environment (Chlanda, Beck, Briggs).

Korrelative Licht- und Elekronenmikroskopie (CLEM) sind Techniken, die die Vorteile der Fluoreszensmikroskopie (hoher Durchsatz, funktionale Analysen, molekulare Identifikation) mit den Vorteilen der Elektronenmikroskopie (hohe Auflösung subzellulärer Architektur) verbinden. Die Entwicklung von CLEM-Methoden und Werkzeugen des letzten Jahrzehnts haben eine Vielzahl von Lösungen für die wissenschaftliche Gemeinschaft hervorgebracht, um komplexe Struktur-Funktion-Fragestellungen in einer Vielfalt biologischer Modelle zu beantworten. CLEM-Methoden sind besonders gut geeignet um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Diese umfassen zahlreiche Ereignisse, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, durch Lichtmikroskopie (LM) analysiert und durch Elektronenmikroskopie (EM) auf ultrastruktureller Ebene genauer charakterisiert werden können.

Das Ziel des Z2-Projektes ist es, CLEM-Anwendungen zu implementieren, anzupassen und zu entwickeln, um dadurch verschiedene Projekte des SFB-Netzwerkes zu unterstützen. Während der ersten Periode des SFB 1129 wurden zwei CLEM-Methoden erfolgreich implementiert und angewandt. Die erste, Live-cell-CLEM, beinhaltet das Auswählen von phänotypischen Zellen durch Live-cell-imaging und das Wiederfinden der Zellen und deren Analyse mittels EM. Diese Methode wurde zur Lokalisierung von Virus-Replikationsorten im Projekt der AG Bartenschlager verwendet (Abb. 1). In der zweiten Methode, On-section CLEM, wird die Fluoreszenz genetisch enkodierter fluoreszenter Proteine während der Probenvorbereitung für das EM erhalten. Scheiben der in Harz gebetteten Proben werden lichtmikroskopisch gescreent, um Positionen der Fluoreszenz mit hoher Präzision zu lokalisieren, die dann mit den entsprechenden TEM-Bildern in Übereinstimmung gebracht werden. Eine genaue Ultrastruktur kann so exakt mit der Expressionsstelle eines markierten Proteins verknüpft werden. Diese Technik, die ursprünglich im Labor von Briggs am EMBL entwickelt wurde, wird innerhalb des SFB 1129 verwendet, um mit dem HIV-1-Virion in Verbindung stehende Proteine und so HIV-Partikel innerhalb der Zelle zu lokalisieren (AG Kräusslich).

Wir sind bestrebt weitere Anwendungsmöglichkeiten für die hier beschriebenen CLEM-Methoden (Live-cell CLEM und On-section CLEM) in anderen SFB-Projekten zu implementieren. Dahingehend planen wir die Anwendung auf komplexere Systeme sowie spezifischer Modelle, die zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen dienen. In diesem Zusammenhang werden neue Markierungsmethoden und deren Anwendbarkeit auf CLEM-Prozesse getestet; wir arbeiten dabei mit den Gruppen Urban/Grimm, Lusic/Beck sowie Cavalcanti-Adam/Spatz zusammen. Außerdem planen wir die Arbeit mit On-section CLEM durch verbesserte Automatisierung der Bildgebung und Registrierung von LM und EM zu vereinfachen.

Darüber hinaus planen wir neuartige CLEM-Methoden in Zusammenarbeit mit folgenden SFB-Gruppen zu implementieren: 1) Die Kombination von Live-cell CLEM mit Cryo-Fixierung und 3D-EM-Analysen (Kräusslich und Bartenschlager); 2) CLEM-Automatisierung für phänotypische Screenings auf ultrastruktureller Ebene (Bartenschlager und Hamprecht/Rohr); 3) 3D-CLEM mit mehrzelligen Proben, um Fluoreszenzbildgebung komplexer Modelle effizient mit zielgerichteter EM zu verbinden (Kräusslich, Fackler und Boulant); 4) In Anbetracht derzeitiger Entwicklungen in Cryo-EM und deren Potential Struktur- und Zellbiologie zu verbinden, werden wir untersuchen, wie man Cryo-CLEM in einer Facility-Umgebung implementieren kann (Chlanda, Beck und Briggs).