Plus-Strang RNA Viren, wie etwa das Hepatitis C Virus (HCV), das Dengue Virus (DENV), das Tick-borne Encephalitis Virus (TBEV), Entero- und Coronaviren, sind medizinisch hoch relevant. Voraussetzung für die produktive Replikation dieser Viren ist die Ausbildung viraler Replikationsfabriken, deren wesentlicher Bestandteil intrazelluläre zytoplasmatische Membranen sind. Wir konnten kürzlich zeigen, dass Membranveränderungen, die durch HCV induziert werden (membranous web) sich von denen des nah verwandten DENV unterscheiden und den Membranveränderungen der entfernt verwandten Entero- und Coronaviren ähneln. Tatsächlich induzieren diese Viren einen „double membrane vesicle“ Morphotyp, während die Strukturen, die durch DENV und TBEV induziert werden, dem „invaginated vesicle“ Morphotyp zugeordnet werden können. Weiterhin konnten wir zeigen, dass der Zusammenbau neuer HCV Partikel in enger Nachbarschaft von Lipidtröpfchen (LDs) stattfindet und sich dort das virale Kapsidprotein und der Replikasefaktor NS5A anhäufen.

Basierend auf diesen morphologischen Studien und in Analogie zu DENV schlagen wir ein Modell vor, in dem funktionale Sub-Kompartimente für RNA Translation, RNA Replikation und die Virusmontage innerhalb des „membranous web“ existieren. Da sich diese Prozesse gegenseitig ausschließen, müssen regulatorische Mechanismen zu deren Koordination existieren. In diesem Projekt möchten wir das aufgestellte Modell überprüfen und drei komplementäre Teilprojekte untersuchen.

Das erste adressiert die molekularen Mechanismen, die der Biogenese der membranösen HCV Replikationsfabriken zugrunde liegen sowie deren detaillierte 3D Architektur. Das zweite Teilprojekt beschäftigt sich mit der Identifikation der drei genannten Sub-Kompartimente innerhalb des „membranous web“. Der dritte Teilaspekt hat zum Ziel, die molekularen Mechanismen zu bestimmen, die der zeitlichen und räumlichen Koordination der verschiedenen Schritte des viralen Replikationszyklus zwischen und innerhalb der einzelnen Sub-Kompartimente zu Grunde liegen. Höchstwahrscheinlich sind aktive Transportprozesse involviert, durch die die viralen Faktoren – vermutlich in Assoziation mit zellulären Faktoren – zwischen den unterschiedlichen Sub-Kompartimenten transportiert werden. Zusätzlich könnten auch zeitlich regulierte Mechanismen eine Rolle spielen, z.B. durch die zeitabhängige Akkumulation oder Modifikation verschiedener viraler Proteine (z.B. Core und NS5A). Wir werden bereits etablierte licht- und elektronenmikroskopische Methoden, einschließlich der Elektronentomographie (ET), einsetzen, um die 3D Struktur der virus-induzierten Membranstrukturen zu eruieren, hochauflösende Lichtmikroskopie und korrelative Licht-Elektronen-Mikroskopie, um die Orte der RNA Translation, Replikation und der Virusmontage zu identifizieren und Lebendzellmikroskopie, um die Dynamik der Transportprozesse zwischen den einzelnen Orten auf Einzelzellniveau zu studieren.

Diese Methoden erfordern die Entwicklung neuer sowie die Anpassung bereits existierender Bildanalyseverfahren, die zwar innerhalb dieses Projekts etabliert werden, aber essentiell für zahlreiche andere Projekten innerhalb des SFBs sind und dort eingesetzt werden (z.B. Müller, Fackler, Ruggieri und Urban). Während die Studien innerhalb der ersten Förderperiode auf der humanen Hepatomzelllinie Huh7 basieren, die hoch-permissiv für HCV ist, haben wir mittelfristig zum Ziel, das erhaltene Wissen auf authentischere Zellkulturmodelle, idealerweise primäre Hepatozyten und Ko-Kulturmodelle, anzuwenden. Langfristig wollen wir vergleichende Analysen mit DENV durchführen, um allgemeingültige Prinzipien in den Replikationszyklen von Plusstrang RNA Viren identifizieren zu können. Dies sollte durch die Verwendung zweier Viren, die jeweils einen der beiden Morphotypen der membranösen Replikationsfabriken induzieren und somit vermutlich alternative Strategien widerspiegeln, wie verschiedenen Schritte des viralen Replikationszyklus koordiniert werden, möglich sein. Mit Hilfe dieser Information sollen dann Breitband-Virostatika entwickelt werden, die die Biogenese und Funktionalität der Replikationskomplexe von Plusstrang RNA Viren hemmen. Neuere Untersuchungen von uns unterstützen diese Hoffnung, da wir mit antiviralen Substanzen, die gegen das HCV NS5A gerichtet sind, eine komplette Inhibition der Biogenese des „membranous web“ nachweisen konnten.